Komórka ręcznie wykonana

Problemy 04-05/1993

Przedstawiamy opis facynujących eksperymentów Jacka Szostaka, noblisty, biologa o poskich korzeniach - eksperymentów dotyczących pierwocin życia na naszej planecie i możliwości powielania się go w miarę naprostrzy ze znanych sposobów. Jack Szostak w swoich eksperymentach próbuje zmusić RNA - a więc bardziej pierwotną cząsteczkę potrafiącą przenosić informacje o genach - do samoreplikacji. Co najbardziej ciekawe, nie tylko udaje mu się pokazać, że takie zachowanie RNA mogło mieć miejsce u najbardziej pierwotnych replikujących się organizmów na naszej planecie, ale też jest w stanie dokonać swego rodzaju EWOLUCJI cząsteczek RNA od tych bardziej zawodnych i niemrawych do bardziej precyzyjnych w działaniu.
To kluczowe. Ewolucja bowiem, wbrew stanowisku kreacjonistów, nie zdarzała się w jednokrotnych aktach tworzenia najbardziej idealnego mechanizmu (podających wadliwy w swoich założeniach przykład małp piszących w sposób przypadkowy tragedię Shakespeare'a), ale w kolejnych żmudnych etapach preferowania w kolejnych pokoleniach tych mechanizmów, które działają odrobinkę lepiej, dają więcej potomstwa, lub, jak w tym przypadku, mniej potomstwa uszkodzonego. Więcej potomstwa oznacza dominację w kilku kolejnych pokoleniach, co z kolei oznacza powolny postęp aż do mechanizmów tak skomplikowanych jak te, których opis możecie obejrzeć w filmach zamieszczonych na końcu tego artykułu.
Świetny przeglądowy artykuł.
Gorąco polecam.
Citronian-Man

----------------------------------------------------------------
        Utrzymanie przy życiu komórek w celach badawczych nie jest trudne. Można je hodować na szalkach Petriego i rozmnażać w probówkach lub też pobrać - na przykład ze swojej własnej skóry. Jack Szostak, mikrobiolog, obrał drogę mniej konwencjonalną. Chce „zbudować” komórkę od początku.
      Trzeba spełnić wiele warunków, aby można było uznać, że komórka jest żywa. Jednokomórkowy organizm (np. bakteria) może pobierać pokarm, rosnąć, przystosowywać się do środowiska, rozmnażać się i ewoluować. Jeśli Szostakowi powiedzie się, to stworzy on właśnie taki organizm choć niezupełnie w znanej nam postaci. Jego komórka będzie miała pęcherzykowatą błonę taką, jak naturalne komórki. Ale prawdziwym triumfem Szostaka będzie maleńki pakunek wewnątrz tej błony - pakunek zawierający kilka nici zbudowanego na zamówienie RNA. W komórkach naturalnych RNA jest najczęściej cząsteczką pośredniczącą: przenosi rozkazy z magazynu instrukcji, jakim jest DNA, do miejsc, w których, zgodnie z tymi instrukcjami, powstają białka. Jednak RNA Szostaka będzie robić coś, co jeszcze kilka lat temu wydawało się zupełnie niemożliwe: będzie przenosić instrukcje i jednocześnie wykonywać je. Zgodnie z tymi instrukcjami każda nić RNA będzie budować swe własne kopie, a proces ten jest, jak się wydaje, podstawą życia.

Aby zrealizować swój plan, Szostak musi uprościć naturalne mechanizmy. Zamiast wielu wyspecjalizowanych cząsteczek DNA jako magazynu instrukcji, RNA jako przenośnika i wielu białek do wykonywania prac „konstrukcyjnych” - potrzebuje on tylko jednej cząsteczki RNA, która zrobi wszystko: będzie zawierać instrukcje, przenosić je na swe własne kopie, używać samej siebie jako narzędzia służącego do kopiowania. RNA Szostaka obłonione, reprodukujące się i być może ewoluujące będzie czymś, co powstało w probówce, ale czymś najbardziej przypominającym żywy organizm. Natura już kilka miliardów lat temu dokonała tego, co chce zrobić Szostak i co jest powszechnie uznawane przez biologów za pierwsze fazy życia. Samoreplikujące się nici RNA były, jak się powszechnie uważa, prekursorami organizmów mających DNA, które dziś zamieszkują Ziemię.

W jaki sposób natura wytworzyła pierwszą samoreplikującą się nić RNA pozostawało dotąd tajemnicą. Niektórzy sądzili, że w jej wyjaśnieniu mogą być pomocne wirusy, z których wiele całą informację o swej reprodukcji zawiera na jednej nici RNA. Jednakże nici te nie działają samodzielnie, ale dopiero po wniknięciu do złożonych struktur żywej komórki.

Wszystkie znane dziś typy replikującego się RNA wymagają uczestnictwa enzymów. Plastyczne cząsteczki enzymów otaczają nici RNA i używają ich jako matryc, na których budują komplementarne nici z fragmentów zwanych nukleotydami. Jeśli wyobrazimy sobie, że RNA jest zbudowane z nukleotydów w czterech kolorach - niebieskim, pomarańczowym, purpurowym i żółtym - to wówczas nukleotydy nowej nici będą miały kolory dopełniające. Tam gdzie oryginalna nić miała nukleotyd niebieski, to komplementarna - pomarańczowy; kiedy oryginalny był purpurowy, to komplementarny - żółty. Komplementarna nić jest jak połówka zamka błyskawicznego, zazębiająca się z oryginalną nicią na całej długości. Ostatecznie dwie nici rozchodzą się, a inny enzym powtarza cały proces na nici komplementarnej, tak że powstaje w końcu nić identyczna z oryginalną. Do pomarańczowego nukleotydu jest dobierany niebieski, zaś do żółtego purpurowy.

Enzymy, które wykonują te prace, są białkami, co oznacza, że muszą powstawać zgodnie z instrukcjami zawartymi w RNA. Inaczej mówiąc, RNA musi kierować składaniem białek enzymatycznych, które z kolei tworzą nowe nici RNA. To piękny system, tylko jak mógł on zacząć pracować? Bez białek niemożliwe byłoby kopiowanie RNA i jego ewolucja, a bez RNA nie ma enzymów.

Około 30 lat temu badacze przedstawili wytłumaczenie: prymitywne cząsteczki RNA mogły działać jak enzymy w procesie swojej własnej replikacji. Dwie identyczne nici współdziałając ze sobą - jedna jako matryca, druga jako enzym - mogły wytworzyć trzecią komplementarną nić. Ta z kolei mogła wytwarzać w ten sam sposób nić taką jak oryginalna itd. W końcu po wielu błędach, które nie przetrwały, i po kilku szczęśliwych udoskonaleniach, które przetrwały, RNA stawało się cząsteczką bardziej złożoną i zdolną do syntezy enzymów, co mogło usprawnić cały proces. Dalszy ciąg to po prostu historia naturalna, jak powiedziałby Darwin.

Problem tkwił jednak w tym, że nikt nie znalazł takiej formy RNA, która spełniałaby podwójną rolę i piękny scenariusz pozostał w sferze hipotez.

Jednakże w 1981 r. biochemik Tom Cech odkrył RNA zdolne do przeprowadzenia prostych reakcji enzymatycznych. Zostało ono wyizolowane z prymitywnego, podobnego do pantofelka, jednokomórkowego organizmu Tetrachymena. Odkrycie to przyniosło Cechowi 3 lata temu Nagrodę Nobla i wsparło teorię samoreplikującego się RNA.

Wkrótce jednak okazało się, jak zauważył Joyce, że różnica między tym, co cząsteczki RNA mogły zrobić, a samoreplikacją, była ogromna. Szybko bowiem stwierdzono, że RNA Cecha, jak i 80 podobnych cząsteczek odkrytych w ciągu kilku lat u wielu mikroorganizmów roślin i grzybów, potrafi jedynie porozcinać nici w kilku specyficznych miejscach oraz przyłączyć kilka nukleotydów na jej końcach. Niewątpliwie nie jest to replikacja. Nikt też nie potrafił znaleźć dowodu na to, że jakieś nie odkryte jeszcze RNA mogą zrobić więcej. Wtedy właśnie do akcji wkroczył Jack Szostak.

Wizerunek Szostaka odbiega od obrazu innych badaczy parających się zagadką życia, którzy o swej pracy mówią dużo i ze swadą. Szostak mówi spokojnie i nie dba o rozgłos. Niełatwo go znaleźć wśród wielu studentów pracujących w bostońskim Massachusetts General Hospital.

Siedem lat temu Szostak rozpoczął badania nad RNA wykonującym funkcje enzymu i który można by zmusić do samoreplikacji. Jednakże istnieje przepaść pomiędzy biochemią cząsteczki zdolnej do przecinania samej siebie a cząsteczki potrafiącej zbudować z nukleotydów swoją wierną kopię. Uważano, że Szostak próbuje dokonać rzeczy niemożliwej. On sam wierzył, że początki życia związane są z RNA, a skoro tak było w naturze, to uda się to powtórzyć w laboratorium. W 1986 r. Szostak rozpoczął prace, a współpracowała z nim Jennifer Doudna.

Pierwsze zadanie polegało na tym, żeby RNA-enzym z Tetrachymena zmusić do przecinania także innych cząsteczek RNA. Wynikało to z faktu, że nić RNA, która ma służyć jako enzym replikacyjny musi działać na matrycy, a ta z kolei musi być obcą cząsteczką RNA. Podzielono więc RNA z Tetrachymena na dwie części: odcinek zbudowany z 300 nukleotydów, który miał przeprowadzać cięcia drugiego, krótszego odcinka, składającego się z około 40 nukleotydów.

Po zsyntezowaniu obu cząsteczek RNA wykonano doświadczenia, w których długi RNA dokonywał cięć RNA krótkiego, a obydwie nici nie były połączone. Uzyskano nawet więcej, bo odwracalność reakcji. Długi RNA, podobnie jak inne enzymy przecinające, mógł dokonywać połączeń (ligacji) łańcuchów, co dawało w rezultacie odtworzoną nić krótkiego RNA. Krótkie odcinki uzyskiwane w wyniku cięcia, zwane oligoodcinkami, składały się z około 20 nukleotydów.

Kolejny krok polegał na tym, aby RNA-enzym zmusić do czegoś więcej niż rozpołowienia nici RNA i ponownego łączenia przeciętych fragmentów. Szostak i Doudna chcieli, aby ich enzym dokonywał replikacji. W tym celu enzym musiał łączyć syntezowane sztucznie wolne oligoodcinki w taki sposób, aby łańcuch który powstanie był komplementarny z krótkim RNA. (Oznacza to, że łańcuch złożony z oligoodcinków i ułożony wzdłuż oryginalnego, czyli krótkiego RNA, miał sekwencje nukleotydów zgodną z zasadą komplementamości: tam gdzie łańcuch oryginalny ma sekwencje niebieski-żółty-pomarańczowy, to oligoodcinek ma pomarańczowy-purpurowy-niebieski.)

Enzym nie łączyłby dowolnych oligoodcinków, gdyż używałby krótkiego RNA jako matrycy. W przeciwnym razie oligoodcinki byłyby łączone w przypadkowy sposób.

Jeśli enzym miałby dokonywać łączenia całkowicie zgodnie z matrycą, to łączyłby tylko te oligoodcinki, które byłyby komplementarne w każdym punkcie łańcucha, zaś unikałby odcinków niekomplementarnych. Znane są następujące nukleotydy i ich połączenia: adenina (A) łączy się z uracylem (U), a guanina (G) - z cytozyną (C). Połączenia te są charakterystyczne dla kwasów nukleinowych, jak opisali to Watson i Crick, a inne kombinacje są nietrwałe. Enzym musi więc sprawdzać, czy każdy nukleotyd na oligoodcinku odpowiada nukleotydowi na matrycy. Następnie enzym musi połączyć dwa końce oligoodcinków. Powstały w ten sposób komplementarny łańcuch staje się następnie matrycą do odtworzenia łańcucha oryginalnego. Niestety RNA z Tetrachymena łączy oligoodcinki mające niekomplementarne nukleotydy, co prowadzi do błędów w replikacji. Stwarzało to badaczom poważny problem.

Postanowiono znaleźć sposób na zmodyfikowanie enzymu, matrycy lub oligoodcinków, tak aby miały tylko dozwolone nukleotydy. Działano na chybił - trafił. Gdy weźmie się bowiem pod uwagę ogromną złożoność reakcji enzymatycznych, inny sposób nie wchodził w rachubę. Szostak i Doudna postanowili po prostu poddać enzym działaniu jakiegoś związku chemicznego, a jedną z wypróbowanych substancji była spermidyna. Związek ten jest małą, elektrycznie naładowaną cząsteczką, która potrafi zmieniać strukturę RNA.

Był to strzał w ciemno, ale szczęście najwyraźniej sprzyjało badaczom. Kiedy dodano spermidynę do mieszaniny różnych nici RNA, RNA-enzym rozpoczął ligację oligoodcinków, które dokładnie pasowały do matrycy. Do dziś nie wiadomo, czy spermidyna zmieniła przestrzenną strukturę enzymu, matrycy, oligoodcinków, czy też wszystkich tych cząsteczek RNA. Ale najważniejsze, że osiągnięto cel.

Szostak i Doudna próbowali następnie sprawić, aby enzym dokonywał ligacji nie tylko oligoodcinków komplementarnych do matrycowego RNA z Tetrachymena, ale także innych oligoodcinków komplementarnych do dłuższego, zsyntezowanego w laboratorium RNA. I znowu enzym działał doskonale, łącząc pięć różnych oligoodcinków w łańcuch o sekwencji komplementarnej do zsyntezowanego RNA. Szansa na to, aby te pięć krótkich nici połączyło się w ten sposób bez matrycy, była praktycznie żadna. Reakcja musiała przebiegać tak, jak oczekiwał Szostak: oligoodcinki były wiązane w komplementarnych miejscach zsyntezowanego RNA, a następnie enzym łączył je.

Jeśli zatem enzym dokonał takiej reakcji na zsyntezowanej matrycy, to dlaczego nie miałby zrobić swej własnej kopii? Tak więc od 1988 r. Szostak i Doudna są na tropie samoreplikującego się RNA.

W istocie jednak osiągnięcie to nie było dokładnie tym, co można by nazwać samoreplikacją. Enzym łączył zgodnie z matrycą stosunkowo długie odcinki RNA, a nie pojedyncze nukleotydy. Jest to zasadnicza różnica, gdyż trudno sobie wyobrazić, że w początkach życia na Ziemi mogły występować w obfitości takie oligoodcinki RNA. Wniosek Szostaka był następujący: „Cały proces doprowadził nas okrężną drogą do punktu wyjścia. Chcieliśmy, aby łączone były odcinki składające się z dwóch, trzech nukleotydów. Wtedy moglibyśmy ułożyć wszystkie przypadkowe kombinacje i pozwolić enzymowi wybrać właściwe”.

Enzym nie miał jednak ani precyzji, ani szybkości działania niezbędnej do wybrania i połączenia około 115 trójnukleotydowych oligoodcinków, które miałyby utworzyć kopię enzymu. Szybkość działania ma duże znaczenie, gdyż oligoodcinki nie są silnie wiązane z matrycowym RNA i enzym musi wykonać ligację, zanim odcinki te oddzielą się od matrycy.

Szostak i Doudna mieli dwie drogi do wyboru: zmodyfikować enzym w kierunku szybszego działania lub też znaleźć enzym zbudowany z krótszej nici, a więc z takiej, która może powstać z mniejszej liczby oligoodcinków. Szostak wybrał tę drugą możliwość.

Badacze byli przygotowani na to, że RNA z Tetrachymena, jakkolwiek dobrze zbadany, może nie działać. Poszukiwania innego systemu prowadzono wśród 50 RNA-enzymów, które zidentyfikowano od momentu rozpoczęcia badań. Szostak i Doudna skupili swoje zainteresowanie na nici RNA zwanej sun Y, znalezionej w bakteryjnym fagu T4. Najważniejszą cechą RNA sun Y jest to, że jest zbudowany z około 200 nukleotydów i jest zarazem najkrótszy w swojej klasie RNA-enzymów.

Okazało się jednak, że sun Y, choć krótszy o połowę od RNA z Tetrachymena i lepiej wykonujący ligację oligoodcinków, był i tak za długi. Nie mógłby połączyć blisko 70 trójnukleotydowych oligoodcinków w jedną nić, czyli nie byłby zdolny do odtworzenia swojego własnego łańcucha. Miałby po prostu za mało czasu i zbyt wiele elementów do złożenia. Aby ułatwić wykonanie zadania, dwójka badaczy odcinała nukleotydy od sun Y w celu sprawdzenia, jak dalece można go skrócić. Okazało się, że jako enzym cząsteczka sun Y musi mieć wszystkie pętle i fałdy, w których utrzymuje oligoodcinki i dokonuje ich ligacji. Gdy więc odcięto zbyt wiele nukleotydów, otrzymywano wprawdzie uproszczoną matrycę, ale nie była ona efektywnym enzymem.

W końcu otrzymano skróconą do 160 nukleotydów wersję sun Y. Początkowo działała słabo jako enzym, ale wkrótce odkryto, że zmiana położenia kilku nukleotydów przywraca normalną dla sun Y efektywność. Niestety i tak enzym był zbyt długi, by pełnić swą drugą rolę - matrycy. W tym momencie prace zostały zatrzymane.

Był to poważny problem, który zmusił badaczy do opracowania zupełnie nowego sposobu działania. Szostak zadał sobie pytanie: co się stanie, jeśli podzielimy enzym na odcinki, które będą mogły same łączyć się w jedną całość?

Bez większych kłopotów Szostak wybrał miejsca, w których można było dokonać przecięć i otrzymać w ten sposób 3 nici o podobnej długości. Wydawało się, że sprzeczne wymagania co do różnych RN A zostały pogodzone. W roztworze w danym momencie można byłoby łączyć niektóre z trzech podjednostek sun Y, a niektóre pozostawałyby nie związane. RNA złożony z trzech podjednostek pełniłby rolę enzymu, a nie związane podjednostki byłyby wystarczająco krótkie, by zostać skopiowane. Kompletne cząsteczki RNA łączyłyby wolne oligoodcinki w komplementarne nici na matrycach, którymi byłyby podjednostki. Komplementarne nici stawałyby się następnie matrycami do odtworzenia wyjściowej podjednostki. W końcu w roztworze znajdowałaby się bardzo duża liczba nowych podjednostek sun Y i niektóre z nich łączyłyby się tworząc nowe enzymy.

Szostak i Doudna przystąpili ponownie do pracy i po 2 tygodniach mogli oglądać rezultat swej koncepcji. Szostak mówi, że był to jeden z najbardziej ekscytujących momentów w całym programie.

Jednakże trzyczęściowy RNA-enzym można uznać za samoreplikujacy się tylko w przybliżeniu. Enzym łączy oligoodcinki o długości około 8 nukleotydów, które są syntezowane w laboratorium. Dopiero gdy enzym będzie zdolny do tworzenia swej własnej kopii z odcinków 2,3-nukleotydowych, będzie można mówić o systemie zbliżonym do naturalnego sprzed 4 miliardów lat. W tej chwili enzym jest zbyt wolny i mało precyzyjny w działaniu, co objawia się tym, że spośród trzech łączonych oligoodcinków jeden nie odpowiada matrycy. Szanse na prawidłowe połączenie 20 odcinków są więc niewielkie. Jest to problem, na którym Szostak chce się teraz skupić, aby zamiast obecnej 70-procentowej dokładności otrzymać 99-procentową.

W dodatku chciałby, aby ten proces wykonała sama natura, co wyjaśnia następująco: „Moglibyśmy pozwolić enzymowi samoreplikować się, replikować błędy i wszystko, co zechce, gdyby cały proces był nieco bardziej dokładny i wydajny. Niektóre z tych błędnych replikacji mogłyby doprowadzić do mutacji, w których efekcie proces przebiegałby wydajniej. Doprowadziłoby to do przewagi tychże mutantów i do powstawania dalszych, a w rezultacie do procesów ewolucyjnych”.

Obecnie Szostak robi coś, co można by nazwać ewolucją ręcznie sterowaną. Kiedy otrzymuje nową porcję sun Y RNA, celowo zmienia sekwencje pewnych nukleotydów, w nadziei, że niektóre spośród miliardów kombinacji okażą się wydajniejszymi enzymami. Aby wyizolować te najbardziej uzdolnione cząsteczki, zaczyna się w takiej próbce RNA dokonywać ligacja różnych cząsteczek. Aby odnaleźć te o najdłuższych cząsteczkach, cała próbka jest przefiltrowana. Następnie wyizolowane zostają mutanty produkujące najdłuższe łańcuchy. Służą one do syntezy nowej partii „lepszego” enzymu, po czym cały proces jest powtarzany. Szostak przyznaje, że do prawdziwej ewolucji jest jeszcze daleko, ale jak zwykle jest optymistycznie nastawiony.

Szostak wykonuje także doświadczenia z fosfolipidami. Dodanie ich do roztworu zawierającego cząsteczki RNA powoduje, że powstają kuliste ciałka zamykające w sobie mikroskopijne ilości roztworu wraz z cząsteczkami RNA. Oczywiście proces ten nawet w przybliżeniu nie odpowiada złożonym reakcjom, jakimi kieruje współczesne DNA w czasie budowy błon komórkowych. Szostak jednak uważa, że kuliste ciałka mogą spełniać wiele funkcji prawdziwych błon. Znalazł już sposób na „wzrost” ciałek przez ich łączenie się z innymi, a także sposób na dzielenie przez przepuszczanie przez porowaty materiał. Obie te metody mogły funkcjonować w naturze 4 miliardy lat temu. Szostak uważa, że oddzielenie się cząsteczek RNA od reszty świata za pomocą błony miało bardzo ważne znaczenie, gdyż RNA mógł wówczas replikować swoje własne interesujące błędy, zamiast dryfować w roztworach.

Nie wszyscy naukowcy są przekonani, że Szostak znalazł sposób na kreowanie żywych organizmów. Biochemik Norman Pace (Indiana University) jest bardzo sceptyczny i nie sądzi, żeby Szostak był na właściwej drodze do stworzenia samoreplikującej się cząsteczki. A jeśli nawet jest, to według Pace’a nie ma żadnych dowodów, że takie były początki życia. Zwłaszcza, że RNA jest cząsteczką bardzo delikatną, która nie przetrwałaby w warunkach panujących na Ziemi 4 miliardy lat temu.

Jednakże Gerald Joyce jest, jak wielu innych, przekonany o słuszności poczynań Szostaka. Joyce nie sądzi, że Szostak chce poznać podstawy procesu, nie zaś odtworzyć z detalami to, co się stało w samych początkach życia. Tom Cech stwierdził natomiast, że koncepcja trzyczęściowego enzymu przekonała go i sądzi, że jeśli Szostak utrzyma dotychczasowe tempo pracy, to otrzyma samoreplikujące się RNA w ciągu dwóch, trzech lat.

Wg „Discover” (nr 8, vol. 13, 1992) oprac. Bogdan Flis

CLAUDINE KARLIN,

NICOLE PIGEOT,

SYLVIE PLOUX,

Pracownia Technologii Prehistorycznej,

Państwowy Ośrodek Badań Naukowych, Paryż

Ważne linki dotyczące autorów:
Biografia Claudine Karlin
Książki Claudine Karlin do kupienia

Książki Nicole Pigeot do kupienia

Publikacje Sylvie Ploux
Opis Kisążki Sylvie Ploux

Biografia Jacka Szostaka - amerykańskiego biologa, noblisty, o poskim pochodzeniu
Książka Jacka Szostaka - The origins of life - do kupienia

Literatura uzupełniająca:
Hoimar Von Ditfurth - Na Początku Był Wodór
Najnowsze doniesienia z badań Jacka Szostaka - w New Scientist

Multimedia:
Świetny film prowadzący nas od eksperymnetów dotyczących odkrycia RNA i DNA przez ekspresję genów aż po możliwości inżynierii genetycznej:
RNA and DNA part1
RNA and DNA part2

Bardzo prosto na temat ekspresji genów czyli tworzenia protein z DNA za pomocą RNA

Bardzo dobra animacja: Jak upakowane w komórce jest DNA? Jak wygląda replikacja dwóch nici DNA z jednej nici?

Zachęcamy do dyskusji na temat podanych w artykule treści
oraz wklejania linków do materiałów multimedialnych.
Redakcja