Chemiczne przekaźnictwo sygnałów w mózgu

 Świat Nauki 01/1994

Jak działa kurara i jad węży?
Jak działają receptory? Z czego się składają i na czym polega otwieranie kanałów przepuszczających jony? Tego wszystkiego można się dowiedzieć z zamieszczonego poniżej, świetnego artykułu napisanego przez profesora Jean-Pierre Changeux'a, wieloletniego badacza tych struktur, dyrektora pionu neurobiologii molekularnej Instytutu Pasteura w Paryżu. 
Gorąco polecam.
Citronian-Man
 

----------------------------------------------------------------

     Badania receptorów acetylocholinowych w rybich narządach elektrycznych w istotny sposób pogłębiły naszą wiedzę o sposobie komunikowania się neuronów w mózgu człowieka

Już w 1904 roku brytyjski uczony T. R. Elliot sugerował, że neurony (komórki nerwowe) często komunikują się między sobą, a także z innymi typami komórek nie na drodze elektrycznej, lecz chemicznej. W myśl tej sugestii potencjał czynnościowy - impuls elektryczny biegnący wzdłuż wzbudzonego neuronu - powoduje uwolnienie przez komórkę substancji chemicznych (dziś zwanych neuroprzekaźnikami). Mogą one z kolei spowodować, że kolejna komórka pobiera lub wypiera określone jony zmieniając przepływ ładunku elektrycznego przez błonę. W ten sposób neuroprzekaźniki inicjują następny impuls.

Od tego czasu naukowcy zidentyfikowali około 50 neuroprzekaźników i stwierdzili, że pojedynczy neuron może wydzielać ich kilka. Wiele wysiłku poświęcili też wyjaśnianiu, jak neuroprzekaźniki, w szczególności mózgowe, regulują transport jonowy i wysyłanie impulsów w komórkach, na które oddziałują.

Rozwiązanie tego ostatniego problemu wyłaniało się powoli, ale badania w moim laboratorium w Instytucie Pasteura w Paryżu oraz w innych placówkach badawczych w ciągu ostatnich 25 lat przyniosły znaczny postęp. Ustaliliśmy, że istotną funkcję pełnią tu wystające z błony komórkowej receptory neuroprzekaźników, które pośredniczą w przetwarzaniu sygnałów chemicznych Zaczęliśmy też wyjaśniać, w jaki sposób wykonują to skomplikowane zadanie pewne podstawowe receptory. Okazało się, że te struktury cząsteczkowe stanowią niezwykle interesującą superrodzinę receptorów neuroprzekainikowych, znanych jako kanały jonowe sterowane neuroprzekaźnikami.

Źródłem znacznej części obecnej wiedzy są intensywne badania nad receptorem wyizolowanym najpierw z narządu elektrycznego ryb elektrycznych, prowadzone w latach siedemdziesiątych i osiemdziesiątych. Wszelako historia tego, jak badaczom udało się rozwiązać tajemnicę chemicznego przekazywania impulsów, zaczyna się właściwie o całe dziesięciolecia wcześniej wraz z odkrywczymi badaniami Johna Newporta Langleya z University of Cambridge. W 1906 roku wysunął on teorię, według której w tkankach ciała miały się znajdować receptory leków. Były to pierwsze istotne wskazówki dotyczące mechanizmu działania neuroprzekaźników.

Swoją teorię Langley oparł na badaniach mechanizmu, który sprawia, że kurara zabija. Przystępując do badań wiedział, że kurara powoduje śmierć przez uduszenie, ponieważ blokuje działanie neuronów motorycznych, odpowiedzialnych za pracę mięśni oddechowych. Zastanawiał się jednak, czy trucizna oddziałuje na neurony, czy na mięśnie. Aby rozstrzygnąć ten problem, naniósł na skrawek mięśnia szkieletowego kurczęcia (w okolicy połączenia nerwów motorycznych) dużą dawkę nikotyny, substancji wywołującej skurcz mięśnia. Skurcz nastąpił zgodnie z przewidywaniami. Następnie zaaplikował kurarę. Trucizna zablokowała działanie nikotyny. Langley wywnioskował, że kurara reaguje bezpośrednio z tkanką mięśniową, na której powierzchni znajduje się „wyjątkowo pobudliwy składnik" lub „substancja receptywna", zdolna do wiązania się z nikotyną lub kurarą.

Neurobiolodzy wiedzą teraz, że nikotyna i kurara łączą się z fragmentem cząsteczki receptora przeznaczonym do wiązania neuroprzekaźnika - acetylocholiny. Związana nikotyna działa jako agonista: naśladuje efekt pobudzający acetylocholiny, substancji będącej naturalnym produktem w organizmie. Odwrotnie działa związana kurara, która jest jej kompetycyjnym antagonistą: nie wysyła sygnału pobudzającego uniemożliwiając jednocześnie jego wysłanie acetylocholinie i nikotynie.

Mimo że koncepcja receptora była błyskotliwa, jej znaczenie przez kilkadziesiąt lat nie było doceniane w środowiskach naukowych. Sceptycyzm wynikał po części z tego, że naukowcy nie dysponowali metodami i narzędziami do izolacji receptorów, mieli natomiast poważne trudności z wyobrażeniem sobie, w jaki sposób wiązanie substancji chemicznej do cząsteczki receptora na powierzchni komórki może wpłynąć na przepływ jonów przez kanały w Wonie komórkowej.

Działanie receptorów acetycholiny na powierzchni mięśniowej (oprac. Citronian-Man) 

Mam osobisty udział w rozpraszaniu tych wątpliwości. W połowie lat sześćdziesiątych pracując nad swoim doktoratem zaproponowałem teoretyczne rozwiązanie tej trudności pojęciowej. Wcześniejsze o parę lat badania nad strukturą hemoglobiny i rozmaitych enzymów wskazywały, że białka te mają kilka oddzielnych miejsc, które mogą wiązać się z innymi substancjami. Ja i moi nauczyciele, Jacques Monod i Franęois Jacob, oraz ich kolega Jeffries Wyman postulowaliśmy, że pewne enzymy mogą być aktywowane w sposób allosteryczny, czyli pośredni, w którym wiązanie w jednym miejscu wpływa na zachowanie innego miejsca wiążącego bez żadnego wsparcia dodatkowych źródeł energii. Zakładaliśmy, że przyłączenie określonej substancji do miejsca wiążącego enzymu może wywołać zmianę konformacji całej cząsteczki, odsłaniając w ten sposób inne odległe miejsce zdolne do reagowania z substratem (substancją przekształcaną przez enzym).

 Alloestryczna (pośrednia) aktywacja receptorów GABAA przez steroidy

RECEPTOR ACETYLOCHOLINOWY, składający się z pięciu
podjednostek (z lewej), był pierwszym receptorem
neuroprzekaźnikowym,który udało się wyizolować. Późniejsze
badania wykazały, że zawiera on nie tylko miejsce wiążące
neuroprzekaźnik, lecz także kanał transportujący jony (z prawej).
(Podjednostki beta i delta oraz część pod jednostki alfa zostały
odcięte dla czytelności obrazu.) Kiedy receptor znajduje się
w stanie spoczynkowym, kanał jest zamknięty, ale otwiera się
niezwłocznie, kiedy obie podjednostki alfa połączą się z
acetylocholiną.

W swojej rozprawie zamieściłem krótką uwagę, że receptory neuroprzekaźników mogą funkcjonować na podobnej zasadzie, a mianowicie zawierać zarówno miejsce wiążące neuroprzekaźnik, jak i oddzielny region będący kanałem jonowym. Przyłączenie się neuroprzekaźnika do miejsca wiążącego może wywołać zmianę konformacji całej cząsteczki, uwieńczoną otwarciem fragmentu stanowiącego kanał jonowy.

Aby ocenić zasadność tej koncepcji, moi współpracownicy i ja musieliśmy szczegółowo przeanalizować skład i strukturę jakiegoś receptora. Do tego celu potrzebne nam były znaczne jego ilości, a niestety w owym czasie żadnego jeszcze nie wyizolowano. Zadanie to stało się więc naszą misją.

Przy wyborze receptora inspiracją stały się odkrycia David a Nachmansohna dokonane już po jego ucieczce z Niemiec hitlerowskich. Podczas pracy w paryskiej Sorbonie w późnych latach trzydziestych Nachmansohn i jego współpracownicy wykazali, że acetylocholina wywołuje nie tylko skurcz mięśnia, lecz także pobudza produkujące elektryczność narządy ryb elektrycznych do wytwarzania prądu. Co więcej, narządy te mają dwie szczególnie cenne dla badaczy zalety. Komórki, z których się składają, tzw. elektrocyty, są olbrzymie, a zatem stosunkowo łatwo z nimi pracować. Ponadto są ich miliardy, co oznacza, że organy elektryczne są bardzo obfitym źródłem cząsteczek receptora acetylocholinowego.

Bardzo dokładne i przejrzyste omówienie działania receptorów (oprac. Citronian-Man) 

Doceniając te zalety, zdecydowaliśmy się na izolowanie receptora acetylocholinowego z narządu elektrycznego węgorza elektrycznego (Electrophorus ciectńcus). By otrzymać preparat nadający się do chemicznej analizy, musieliśmy najpierw rozbić zawarte w narządzie elektrocyty. Ja i Michiki Kasai (obecnie pracujący w Uniwersytecie w Osace) mieliliśmy tkankę elektryczną. Następnie z unerwionych części elektrocytów oddzielaliśmy mikronowej wielkości fragmenty błon. Badania Langleya nad tkanką mięśniową sugerowały, że w obszarach unerwionych znajdziemy duże zagęszczenie receptorów. Owe fragmenty błon mają cudownie użyteczną właściwość: zasklepiają się w mikrosaszetki, maleńkie pęcherzyki, które napełniać można znakowanymi radioaktywnie jonami sodu (Na+) i potasu (K+).

Jak można było oczekiwać (przy założeniu, że na powierzchni tych pęcherzków znajdują się funkcjonalne repliki receptorów), dodanie acetylocholiny do zawiesiny pęcherzyków radykalnie zmieniało przepływ jonów z i do ich wnętrza, tak jak zachodzi to w nie naruszonych elektrocytach reagujących na acetylocholinę. Co więcej, zgodnie z uprzednio postulowanym mechanizmem allosterycznym reakcja ta nie wymagała dodatkowego źródła energii Byliśmy więc w miarę pewni, że w błonach pęcherzyków znajdują się działające receptory. Wciąż jednak poszukiwaliśmy sposobu odróżnienia receptora od reszty materiału błonowego. W owym czasie jedyną metodą wyznaczenia konkretnego typu cząsteczki w błonie było oznakowanie radioaktywne substancji, która wiązała się silnie i wybiórczo z interesującą nas cząsteczką. Znalezienie takiej substancji sprawiało nam sporo kłopotu, dopóki nie przyszedł nam z pomocą Chen-Yuan Lee z Narodowego Uniwersytetu Tajwanu.

Lee odwiedził moje laboratorium wiosną 1970 roku, aby przedstawić swoje badania nad strukturą i sposobem działania jadu węża. Ukąszenia niektórych węży, takich jak dasznik prążkowany (Bungarus multicinctus) czy kobra, są śmiertelne, ponieważ ich jad zawiera toksyczne cząsteczki, podobnie jak kurara blokujące przekazywanie sygnałów przez neurony motoryczne. Do cząsteczek tych należą m.in. alfa toksyny. Lee stwierdził, że alfa-bungarotoksyna z jadu dasznika prążkowanego nawet w niskich stężeniach prawie nieodwracalnie blokuje działanie acetylocholiny na mięśnie ewolucyjnie zaawansowanych kręgowców. Zdałem sobie sprawę, że dzięki alfa-bungarotoksynie możemy uzyskać wybiórczość konieczną do zidentyfikowania receptorów acetylocholinowych na powierzchni pęcherzyków otrzymywanych z elektrocytów. Ku naszej wielkiej radości dostarczona przez Lee toksyna spełniła te oczekiwania.

DRĘTWA ELEKTRYCZNA z rodzaju Torpedo ma produkujący
energię elektryczną narząd, który zawiera miliardy egzemplarzy
receptora acetylocholinowego. Ustalenie sekwencji aminokwasów
tego receptora doprowadziło do odkrycia, że struktura receptorów
acetylocholinowych w ludzkich mięśniach i mózgu jest podobna do
struktury receptora Torpedo.

Wreszcie mogliśmy zająć się oczyszczaniem receptora, który, jak przekonaliśmy się wkrótce, okazał się białkiem. Do roku 1974 starania nasze i innych grup badaczy uwieńczone zostały sukcesem. Mój zespół osiągnął ten cel stosując technikę zwaną chromatografią powinowactwa. Wyprodukowaliśmy nierozpuszczalne paciorki, do których dołączone były gałązki zakończone strukturalnym analogiem kurary. Przez te paciorki przepuszczaliśmy błony pęcherzyków rozpuszczone najpierw w roztworze detergentu, aby rozdzielić ich poszczególne składniki. Wolne cząsteczki receptora wiązały się z umocowanym na paciorkach analogiem kurary. Pozostałe składniki błony były odmywane. Następnie zalewaliśmy paciorki roztworem analogu kurary. Cząsteczki receptorowe wiązały się preferencyjnie z analogiem kurary znajdującym się w roztworze uwalniając się z paciorków. Przepuszczając otrzymany roztwór kompleksu analogu z receptorem przez błonę przepuszczalną jedynie dla substytutu kurary, eliminowaliśmy analog i otrzymywaliśmy czysty roztwór receptora.

Pragnąc jak najszybciej dowiedzieć się czegoś o strukturze naszej zdobyczy, dostarczyliśmy jej próbki Jeanowi Cartaudowi z Instytutu Jacquesa Monoda w Paryżu, by obejrzał je pod mikroskopem elektronowym. Stwierdził on, że widziany z góry receptor przypomina rozetkę z centralnie umieszczonym wgłębieniem. Kolejnych analiz dokonali Arthur Karlin z Columbia University College of Physicians and Surgeons i Michael Raftery z California Institute of Technology (Caltech). Wynikało z nich, że cała cząsteczka receptora zbudowana jest z pięciu łańcuchów białkowych, czyli pod jednostek: dwóch łańcuchów alfa o identycznym ciężarze cząsteczkowym i trzech łańcuchów, nazwanych beta, gamma i delta, różniących się ciężarem cząsteczkowym. Co więcej, Karlin wykazał, że to podjednostki alfa są przede wszystkim odpowiedzialne za „rozpoznanie" acetylocholiny. (Dziś wiemy już, że do otwarcia kanału jonowego konieczne jest zajęcie miejsca wiążącego na obu pod jednostkach alfa.)

Zaintrygowały nas te wyniki. Sugerowały one, że każda z podjednostek może stanowić jeden z „płatków" rozetki, a wgłębienie centralne jest odzwierciedleniem zewnątrzkomórkowego wlotu do kanału jonowego, przebiegającego przez błonę komórkową. Aby zweryfikować tę koncepcję, potrzebowaliśmy więcej danych. Tymczasem musieliśmy rozstrzygnąć jeszcze jeden problem. Czy mogliśmy mieć pewność, że otrzymana cząsteczka receptora zawiera kanał jonowy, a nie wyłącznie miejsce wiążące acetylocholinę?

W 1974 roku wraz z Geraldem L. Hazelbauerem rozstrzygnęliśmy tę wątpliwość, wbudowując białko z oczyszczonego ekstraktu pęcherzyków w błony lipidowe otaczające znakowane radioaktywnie jony sodowe lub potasowe. Wiązanie acetylocholiny wyzwalało przepływ jonów, a wiązanie alfa-bungarotoksyny i kurary blokowało ten efekt, co było zgodne z założeniem obecności kanału jonowego. Później potwierdziliśmy te wyniki na oczyszczonych receptorach. Zatem do roku 1980 nasza i inne grupy wykazały jasno, że czyste białko zawiera istotnie wszystkie elementy strukturalne potrzebne do chemicznego przekaźnictwa sygnału elektrycznego, czyli miejsce wiążące acetylocholinę, kanał jonowy i mechanizm łączący działanie jednego i drugiego.

Aby do końca zrozumieć mechanizm działania receptora, musieliśmy rozszyfrować jego sekwencję aminokwasową. Ta informacja dostarcza wskazówek, jaki kształt przyjmuje białko, będące głównie sznurem aminokwasów, kiedy zacznie owijać się wokół siebie, znajomość zaś zwiniętej struktury pozwala domyślać się, jakie są funkcje poszczególnych jej części.

Anatomia receptora acetylocholinowego

Główne elementy struktury receptora acetylocholinowego powoli
stawały się dostępne badaniom. Jego pięć podjednostek
(wstawka na górnym rysunku), które schematycznie można
przedstawić w postaci walców (pośrodku u góry), zbudowane jest
ze zwiniętego wokół siebie białka (u góry z prawej). Każda
podjednostka zawiera duży obszar hydrofilowy („wodolubny") ze
strony końca aminowego (NH2) oraz cztery segmenty hydrofobowe
(„wodowstrętne") M1, M2, M3 i M4, przechodzące przez błonę
komórkową. Miejsce wiążące neuroprzekaźnik widziane od góry
na rysunku środkowym (wstawka) złożone jest głównie z
aminokwasów (żółte kulki) dużego obszaru hydrofilowego
podjednostki alfa. (Litery na kulkach określają konkretne
aminokwasy.) Sąsiednie podjednostki też w tym uczestniczą
(różowe kulki). Kanał jonowy składa się z pięciu segmentów M2
(wstawka na rysunku dolnym) i zawiera kilka złożonych z
aminokwasów pierścieni, które wpływają na działanie receptora.
Trzy spośród nich ujemnie naładowane (niebieskie na schemacie
obrazującym dwa segmenty M2 receptora acetylocholinowego)
wciągają dodatnio naładowane jony (niewidoczne) przez kanał.
Pozbawiony ładunku pierścień złożony z reszt leucynowych
(zieloni) w połowie długości kanału, gdzie segmenty M2
przypuszczalnie się wyginają, bierze udział w zamykaniu kanału
jonowego z chwilą przejścia receptora w stan odczulenia na
acetylocholinę. Mapa gęstości elektronowej (u dołu z lewej)
ukazująca przekrój receptora wskazuje przypuszczalną orientację
dwóch segmentów M2 (grube, ciemne linie). Sporządził ją Nigel
Unwin z Medical Research Council w Cambridge, w Anglii.

Wprowadzenie pod koniec łat siedemdziesiątych automatycznego sekwencjonowania białek i technik inżynierii genetycznej znacznie ułatwiło to zadanie. W 1979 roku moja współpracownica Anne Devillers-Thiśiy, Donny Strosberg z Instytutu Jacquesa Monoda i ja ustaliliśmy sekwencję pierwszych 20 aminokwasów jednego z końców (tzw. N-końca zakończonego grupą aminową) pod jednostki alfa receptora acetylocholinowego europejskiej drętwy elektrycznej, zwanej też marmurkowatą (Torpedo marmorata). Następnie Raftery i Leroy E. Hood oraz ich współpracownicy z Caltech rozszyfrowali niemal identyczną sekwencję u kalifornijskiej drętwy elektrycznej (T. californica) - i pracowali dalej. Po scharakteryzowaniu 54 aminokwasów od strony N-końców pod jednostek alfa, beta, gamma i delta niespodziewanie stwierdzili ich uderzające podobieństwa. We wszystkich czterech pod jednostkach sekwencja była identyczna lub homologiczna w 35 do 50 procentach.

Według specjalistów biologii molekularnej zjawisko takie najprawdopodobniej oznacza, że geny określające sekwencje poszczególnych pod jednostek są potomkami jednego genu protoplasty, któiy dwukrotnie w toku ewolucji uległ duplikacji, a następnie modyfikacjom. Homologia ta sugerowała ponadto, że cafe pod jednostki są zbudowane podobnie, a zatem układają się najprawdopodobniej w quasi-symetryczny sposób wokół osi centralnej, tworząc płatki rozetki widzianej pod mikroskopem elektronowym.

W1983 roku dysponowaliśmy już bardziej konkretnymi informacjami Shosaku Numa i jego zespół z Uniwersytetu w Kioto rozwikłali pełną sekwencję pod jednostki alfa, a następnie beta, gamma i delta receptora T. californica. Trzy inne laboratoria, włącznie z moim, także zidentyfikowały sekwencję podjednostki gamma T. californica i podały sekwencję podjednostki alfa T. marmorata. Następnie Numa opublikował sekwencje wszystkich podjednostek receptora acetylocholinowego mięśnia ludzkiego. Jak się okazało, receptor mięśniowy niewiele różnił się od receptorów elektrocytów.

Te wyniki dały badaczom doskonałą podstawę do ustalenia architektury zwiniętych podjednostek i poznania sposobu, w jaki dopasowują się do siebie. Aby ustalić strukturę zwiniętego białka, naukowcy często przeglądają liniową sekwencję łańcucha aminokwasowego w poszukiwaniu odcinków bogatych w aminokwasy hydrofilowe albo hydrofobowe. Substancje hydrofilowe („wodolubne") przyciągane są przez wodę zawartą w cytoplazmie łub przestrzeni międzykomórkowej; substancje hydrofobowe („wodowstrętne") wolą towarzystwo innych tworów hydrofobowych, takich jak lipidy błon komórkowych.

Każda z podjednostek, których sekwencję ustalono, zaczynała się na N-końcu dużym obszarem hydrofilowym i zawierała cztery oddzielne segmenty hydrofobowe, około 20 aminokwasów każdy. Poczynając od strony długiego odcinka hydrofilowego te obszary hydrofobowe oznaczane są kolejno jako Ml, M2, M3 i M4. Układ ten sugeruje, że łańcuch każdej podjednostki przewija się przez błonę komórkową czterokrotnie, tak że każdy z regionów hydrofobowych przechodzi w poprzek błony [patrz ramka na poprzedniej stronie].

Co najmniej w jednym modelu duży obszar hydrofilowy wystawał w przestrzeń pozakomórkową. Takie usytuowanie na pod jednostce alfa (odpowiedzialnej głównie za wychwycenie acetylocholiny) byłoby doskonałe do wiązania neuroprzekaźnika. Ponadto rozsądne wydawało się przypuszczenie, że jeden z przenikających błonę hydrofobowych fragmentów każdej z pięciu podjednostek w połączeniu z pozostałymi tworzy kanał jonowy. Analogiczne fragmenty hydrofobowe podjednostek mogłyby tworzyć taki kanał, gdyby wspólnie otaczały oś centralną rozetki.

Późniejsze badania potwierdziły to przypuszczenie i uzupełniły dodatkowymi szczegółami. Wcześniej jednak sekwencjonowanie białek poszczególnych podjednostek pozwoliło naukowcom wyjaśnić nieporozumienia wokół sposobu działania receptorów acetylocholinowych w mózgu. Źródłem problemów była reakcja niektórych z tych receptorów na jad węży.

Już we wczesnych latach osiemdziesiątych wiedziano, że w mózgach wyższych kręgowców obecne są wrażliwe na nikotynę receptory acetylocholinowe, zwane nikotynowymi. Neurobiologów intrygowało jednak, dlaczego alfa-bungarotoksyna blokowała, jak się wydawało, tylko niektóre z nich. Co więcej, toksyna Bungarus, zwana bungarotoksyną neuronalną, łączyła się z pewnymi receptorami acetylocholinowymi w mózgu, a z innymi nie. (Proces ten jest w istocie nieco bardziej skomplikowany. W mózgu występują dodatkowo receptory acetylocholinowe, zwane muskarynowymi, których tutaj omawiać nie będę. Różnią się one zasadniczo od receptorów nikotynowych. Zbudowane są z pojedynczego łańcucha białkowego i nie zawierają kanału jonowego. Ich działanie związane jest z wewnątrzkomórkowymi przekaźnikami drugorzędowymi w rodzaju białka G.)

Mgła rozproszyła się, kiedy James W. Patrick, Stephen F. Hejnemann i ich współpracownicy z Salk Institute for Biological Studia w San Diego oraz Marc Ballivet z Uniwersytetu w Genewie zastosowali swoją wiedzę o strukturze podjednostek receptorów mięśni i elektrocytów do rozszyfrowania sekwencji aminokwasów receptorów mózgowych. Badacze ci założyli, że sekwencje aminokwasowe podjednostek receptorów mózgowych powinny być podobne do ich odpowiedników w mięśniach i elektrocytach, mimo że niektóre receptory mózgowe zachowywały się w nieco odmienny sposób. Jeżeli białka te miały zbliżoną strukturę, to geny określające ich sekwencję aminokwasową również powinny być podobne. W takim razie można było oczekiwać, że proces zwany hybrydyzacją DNA pomoże w izolowaniu genów poszczególnych podjednostek receptorów mózgowych, przyczyniając się w ten sposób do wyznaczenia ich sekwencji.

Technika hybrydyzacji DNA wykorzystuje istotną właściwość genów. Składają się one z dwóch łańcuchów nukleotydów (cegiełek, z których zbudowany jest DNA). Pojedynczy łańcuch skwapliwie łączy się, czyli hybrydyzuje ze swoim odpowiednikiem z tego samego lub blisko z nim spokrewnionego genu. Świadomi tej właściwości badacze mieli nadzieję „wyłowić" geny podjednostek mózgowego receptora z ogólnej puli mózgowego DNA, używając jako „przynęty" sekwencji nukleotydowej sterującej syntezą podjednostek w elektrocytach lub mięśniach. Procedura ta przyniosła wspaniałe rezultaty. Zidentyfikowano siedem typów podjednostki alfa (wszystkie ponumerowano) produkowanych w mózgach kręgowców, nie wyłączając ludzi. Odkryto również trzy typy nie będące podjednostkami alfa, które klasyfikowane są często jako podjednostki beta, choć istnieją w tym względzie kontrowersje. Ta rozmaitość typów sugerowała, że źródłem odmiennych reakcji na działanie jadu węży mogą być drobne różnice w sekwencjach aminokwasowych jednej lub kilku podjednostek.

Późniejsze badania wykazały, że funkcjonalny receptor może powstać w komórce, jeżeli ma ona geny kodujące strukturę przynajmniej jednego wariantu podjednostki alfa i jednego wariantu którejś z pozostałych podjednostek. Eksperymenty, z których to wynikało, pole

gały najczęściej na wprowadzaniu genów do jądra oocytu, niedojrzałej komórki jajowej żaby Xenopus. W odpowiedzi na ten zabieg produkujące białko struktury oocytu przeprowadzają transkrypcję genu w informacyjny mRNA i - po przetransportowaniu go do cytoplazmy - syntezę pożądanego białka w procesie translacji. Zsyntetyzowane białka łączą się następnie w grupy po pięć jednostek tworząc receptory.

Badania mnogości receptorów wyprodukowanych przez oocyty żaby Xenopus wykazały też, że zastąpienie jednej podjednostki inną rzeczywiście może zmienić niektóre własności receptora. Na przykład bungarotoksyna neuronalna blokuje reakcję na acetylocholinę receptorów złożonych z podjednostek beta-2 i albo alfa-3, albo alfa-4, natomiast nie wpływa na aktywność struktur złożonych z podjednostek beta-2 i alfa-2.

Mniej więcej w tym samym czasie, kiedy stwierdzono, że nikotynowe receptory cholinergiczne są heterogenne, naukowcy pracowali pilnie nad rozszyfrowaniem struktury i sposobu działania receptorów innych neuroprzekaźników. Na początku mało kto przypuszczał, że receptory glicynowe i receptory kwasu γ-aminomasłowego (GABA) mogą mieć wiele cech wspólnych z receptorem acetylocholinowym. Przede wszystkim nikotynowy receptor acetylocholinowy pobudza komórkę, otwierając kanał przepuszczający kationy (jony z ładunkiem dodatnim). Receptory glicynowe i GABA - przeciwnie - ułatwiają transport anionów chlorkowych (CT). Przepływ tych anionów do wnętrza komórki hamuje wyzwalanie impulsów elektrycznych i może w ten sposób przeciwstawiać się działaniu receptorów pobudzających.

Badania przeprowadzone w 1980 roku wykazały jednak, że receptory GABA i glicynowe również składają się z kilku podjednostek. Ta informacja nie była szczególnie znacząca. Bardziej interesujące okazało się odkrycie Heinricha Betza z Uniwersytetu w Heidelbergu i Erica A. Barnarda z Medical Research Council w angielskim Cambridge: pierwszy z nich określił całkowitą sekwencję receptora glicynowego, drugi dokonał tego samego dla receptora GABA. W obu przypadkach rozkład regionów hydrofilowych i hydrofobowych był mocno zbliżony do rozkładu obserwowanego w nikotynowym receptorze acetylocholinowym.

Innymi słowy, można było przypuszczać, że podjednostki receptorów GABA i glicynowych, podobnie jak podjednostki receptora nikotynowego, przewijają się przez błonę czterokrotnie. Wyniki wskazywały również, że kompletne receptory dla GABA i glicyny zawierały zarówno miejsce wiążące neuroprzekaźnik, jak i kanał jonowy. Z najnowszych badań wynika, że niektóre z receptorów serotoninowych mogą być podobnie zbudowane Te ostatnie tak jak receptory acetylocholinowe kontrolują przepływ kationów przez błonę, a zatem należą do receptorów pobudzających.

ROZWINIĘTE ŁAŃCUCHY BIAŁKOWE (różnokolorowe paski),
tworzące podjednostki receptorów acetylocholinowych, GABA
i gl icy nowych,mają wiele cech wspólnych: duży
zewnątrzkomórkowy obszar hydrofilowy, mniejszy obszar
hydrofilowy cytoplazmatyczny i cztery segmenty hydrofobowe
(Ml, M2, M3 i M4), które, jak się sądzi, przechodzą przez
błonę komórkową. Podobieństwa te sugerują, że wszystkie
należą do jednej wielkiej rodziny strukturalnie
spokrewnionych receptorów neuroprzekaźnikowych.

Podobieństwa w budowie pomiędzy receptorami tłumaczą, dlaczego neurobiolodzy uważają dziś, że receptory GABA, acetylocholinowe, glicynowe i serotoninowe tworzą wielką rodzinę genetycznie i strukturalnie spokrewnionych kanałów jonowych, sterowanych neuroprzekaźnikami. (Receptory występującego w znacznych ilościach neuroprzekaźnika - glutaminianu - mogą być z nimi daleko spokrewnione. Zawierają one miejsce wiążące neuroprzekaźnik oraz kanał jonowy, lecz strukturę mają odmienną.) Mamy również dowody, że kanały jonowe sterowane neuroprzekaźnikami są białkami allosterycznymi. Zgodnie z tym, co wiadomo o cząsteczkach allosterycznych, odległość pomiędzy miejscem wiążącym neuroprzekaźnik a kanałem jonowym ocenia się jako znaczną - około 30 angstremów.

Tak jak receptor acetylocholinowy podjednostki innych członków tej wielkiej rodziny również występują w kilku odmianach. Zatem receptor GABA w jednym obszarze mózgu może mieć nieco inne właściwości niż jego wariant w innym obszarze. Na przykład benzodwuazepiny, w krajach uprzemysłowionych masowo używane jako środki uspokajające, zwiększają hamujące działanie tylko niektórych typów receptora GABA dzięki wiązaniu się do innego niż GABA miejsca.

W miarę wyjaśniania, jaki wpływ na zachowanie ma każdy pod typ poszczególnej podjednostki w kanałach jonowych sterowanych neuroprzekaźnikami, farmakolodzy będą mogli zaprojektować leki selektywnie wzmacniające lub hamujące ten wpływ. Leki te powinny łagodzić wiele upośledzających schorzeń, włącznie z zaburzeniami nastroju, uszkodzeniami tkanki po wylewie, a być może i chorobą Alzheimera.

Projektowanie takich leków oczywiście wymaga od naukowców dogłębnego zrozumienia struktury receptora. Muszą wiedzieć, które aminokwasy odpowiedzialne są za wiązanie neuroprzekaźnika, które za sterowanie przepływem jonów z i do komórki, a które za inne zmiany w funkcjonowaniu receptora. Jeden z praktycznych sposobów zbierania takich informacji znany jest jako znakowanie przez powinowactwo. Najpierw wyszukuje się łatwo wykrywalny analog substancji reagującej z receptorem, a potem pozwala mu się przyłączyć w sposób nieodwracalny do miejsca wiążącego. Dzięki temu związana substancja „oświetla" aminokwasy tworzące to miejsce.

W latach 1988-1990 moi współpracownicy: Michael Dennis, Jśróme Giraudat, Jean-Luc Galzi i ja rozpracowaliśmy znaczny obszar miejsca wiążącego acetyiochohnę dzięki zidentyfikowaniu aminokwasów receptora Torpedo, które daty się znakować substancją o nazwie fluoroboran p-W,N-dimetyi) aminobenzenodiazonium, znaną również jako DDF. Stwierdziliśmy, że dla wiązania DDF zasadnicze znaczenie mają niektóre aminokwasy aromatyczne (te z kształtującymi się w pierścień łańcuchami bocznymi) i potwierdziliśmy fakt wiązania DDF z parą cysteinową, zidentyfikowaną w receptorze Torpedo przez Karlina. Znakujące się aminokwasy znajdują się w trzech wydzielonych regionach dużego obszaru hydrofilowego na aminowym końcu łańcucha. Stało się jasne, że wspólnie tworzą one rodzaj ujemnie naładowanego wgłębienia, w którym zakotwiczyć może dodatnio naładowany fragment acetylocholiny.

DYNAMICZNY CHARAKTER receptora acetylocholinowego
przejawia się w jego zdolności do przyjmowania wielorakich
stanów konformacyjnych. W stanie spoczynkowym (a) receptor
ma niskie powinowactwo do acetylocholiny, a jego kanał jonowy
jest zamknięty. Jeżeli przez krótki czas wystawiony zostanie
na działanie wysokiego stężenia acetylocholiny, to na kilka
milisekund przyjmie konformaqę aktywną z otwartym kanałem
(b), by następnie uwolnić acetylocholinę i powrócić do stanu
spoczynkowego. W przypadku stałego dopływu acetylocholiny
zarówno aktywne, jak i spoczynkowe receptory mogą powoli
przechodzić w stan odczulony (c). W tej konformacji receptor
ma wysokie powinowactwo do acetylocholiny i przetrzymuje ją
związaną przez sekundy lub nawet minuty, nie otwierając kanału
jonowego i nie reagując na kolejne dawki neuroprzekaźnika.

Co ciekawsze, wykazaliśmy też, że te właśnie aminokwasy odgrywają istotną rolę w działaniu receptora. Udowodniliśmy to wraz z Danielem Bertrandem z Centrum Medycznego Uniwersytetu w Genewie, posługując się receptorem składającym się wyłącznie z pod jednostek alfa-7 z mózgu kurczaka. (Receptor ten jest jedynym wyjątkiem od reguły, zgodnie z którą do sformowania jednostki funkcjonalnej konieczna jest obecność zarówno pod jednostek alfa, jak i beta.) Mutacja specyficzna aminokwasów znakowanych przez DDF w receptorze Torpedo, czyli mutageneza cełowana w określone miejsce, w uderzający sposób osłabiła reakcję receptora alfa-7 na acetylocholinę.

Wyniki badań z zastosowaniem zarówno znakowania przez powinowactwo, jak i mutagenezy potwierdzają, że duży obszar hydrofilowy pod jednostki alfa zwrócony jest ku środowisku zewnątrzkomórkowemu. Jest on gotowy do przyjęcia acetylocholiny uwolnionej z zakończeń nerwowych i rozpoczyna proces otwierania kanału transportującego jony.

Znakowanie przez powinowactwo pozwoliło również na zarysowanie struktury kanału jonowego w receptorze Torpedo. W wyniku żmudnych analiz po koniec 1985 roku nabraliśmy przekonania, że lek zwany chloropromazyną przyłącza się do aminokwasów na przenikającym błonę komórkową hydrofobowym segmencie M2 przynajmniej jednej pod jednostki - delta. Z naszych prac i podobnego doniesienia Ferdinanda Hucho i jego współpracowników z Uniwersytetu Berlińskiego wynikało, że wewnętrzną ścianę kanału jonowego tworzy pięć segmentów M2, po jednym z każdej podjednostki.

Numa i Bert Sakmann, wówczas z Instytutu Chemii Biologicznej Maxa Plancka w Getyndze, potwierdzili, że jest to możliwe. Stosując mutację specyficzną zaobserwowali, że w transporcie jonów przez kanał biorą udział co najmniej trzy pierścienie utworzone z aminokwasów (szczególnie glutaminianu) o ujemnym ładunku. Każdy pierścień leży w płaszczyźnie równoległej do powierzchni komórki i składa się z pięciu aminokwasów pochodzących z segmentów M2 każdej z podjednostek. Pierwszy pierścień zajmuje miejsce na zewnątrz komórkowej powierzchni błony (u szczytu kanału). Drugi, zwany pierścieniem pośrednim, leży na dnie kanału, a trzeci tuż pod nim w cytoplazmie.

Zważywszy na podobieństwa w rozkładzie hydrofobowych podjednostek receptorów GABA, glicynowych i serotoninowych do rozkładu obserwowanego w receptorach acetylocholinowych zastanawialiśmy się, czy segmenty M2 nie tworzą kanałów jonowych również w receptorach GABA, glicynowych i serotoninowych. Okazuje się, że istotnie tak jest, mimo że receptory te transportują jony naładowane ujemnie, a nie dodatnio. Różnica w preferencji określonego ładunku wynika z odmienności kilku zaledwie aminokwasów. Kiedy zespołom Bertranda i mojemu udało się przenieść do receptora alfa-7 trzy aminokwasy z podjednostki M2 receptora GABA (łącznie z tym, który inicjuje pierścień pośredni), te niewielkie w sumie zmiany przekształciły kanał receptora alfa-7 z transportera kationowego w anionowy.

Niezależnie od tego, czy receptor zawiera kanał kationowy, czy anionowy, jego głównym zadaniem jest otwieranie tego kanału w odpowiedzi na sygnał neuroprzekaźnika. Receptory neuroprzekaźnikowe mają jeszcze jedną fascynującą cechę. Dzięki zmianie własnej konformacji najwyraźniej potrafią zwiększać lub zmniejszać własną gotowość do reagowania na neuroprzekaźnik. Mogą w ten sposób regulować ilość receptorów dostępnych dla sygnałów zewnętrznych i wpływać na sprawność przekaźnictwa impulsów.

Wraz ze współpracownikami zdaliśmy sobie sprawę, że receptory mogą mieć taką moc samoregulacji, kiedy zaczęliśmy analizować zjawisko odnotowane przez kilku badaczy, a mianowicie, że receptory inaczej reagują na pojedyncze pulsy wysokiego stężenia acetylocholiny (takie jak zazwyczaj aplikują im neurony) niż na ciągłą dostępność niskich stężeń neuroprzekaznika (jak w wielu modelach doświadczalnych).

Pobudzone neurony w pojedynczych wyładowaniach wyzwalają duże stężenia acetylocholiny do synaps, wyspecjalizowanych połączeń neuronów, które jak dziś już wiemy, służą międzyneuronalnej komunikacji. Uwolnione w pojedynczym pulsie cząsteczki neuroprzekaźnika wlewają się do szczeliny synaptycznej (przestrzeni oddzielającej komunikujące się komórki). W normalnych okolicznościach powinowactwo większości cząsteczek receptora do neuroprzekaźnika jest niskie. W rezultacie, gdy cząsteczka acetylocholiny zwiąże się z receptorem i spowoduje otwarcie kanału jonowego, zostaje uwolniona z receptora i niezwłocznie unieczynniona. W ciągu milisekund od chwili, w której nastąpiło wiązanie, receptor powraca do stanu zamkniętego, nie związanego, i gotów jest do następnej reakcji.

Kiedy jednak acetylocholina dociera do receptora w sposób ciągły, jego cząsteczki zaczynają tracić reaktywność. Otworzywszy wstępnie kanał jonowy przechodzą powoli w stan konformacji „odczulonej", co może trwać kilka sekund lub minut. Oznacza to, że nadal łapczywie wiążą acetylocholinę, lecz kani utrzymują w stanie zamkniętym i nie transportują jonów. „Odczulone" receptory z zamkniętym kanałem jonowym utrzymywać będą w stanie związanym nawet niskie stężenia acetylocholiny przez dłuższy czas, w którym nie będą zdolne do reakcji na nowe impulsy.

Wydaje się więc, że receptory acetylocholinowe mogą przyjmować przynajmniej trzy wzajemnie wymienne konformacje, różniące się powinowactwem do neuroprzekaźnika i efektywnością transmisji sygnału. Oprócz stanu odczulonego o wysokim powinowactwie do neuroprzekaźnika, w którym kanał pozostaje zamknięty, jest jeszcze stan spoczynkowy (ale łatwo ulegający aktywacji) o niskim powinowactwie, w którym kanał jest zamknięty, lecz z łatwością ulega otwarciu, jeżeli acetylocholina zwiąże się raptownie z obiema podjednostkami alfa.

Trzecia możliwość to stan niskiego powinowactwa przy otwartym kanale. Receptor w sposób ciągły spontanicznie przybiera wszystkie formy, ale przejścia te zachodzą z inną prędkością niż w obecności acetylocholiny.

ROZMAITE SIŁY mogą wpływać na konformację receptora
neuroprzekaźnikowego i co za tym idzie, na wydajność,z jaką
reaguje on na sygnały docierające z oddziałującego nań
neuronu. Oprócz stężenia i szybkości dostarczania
neuroprzekaźnika (a) pewien wpływ może miec wiązanie innego
neuroprzekaźnika lub jakiejś substancji chemicznej (b),
zmiana błonowego potencjału elektrycznego (c) i wiązanie
sygnałowych cząsteczek wewnątrzkomórkowych (J), na przykład
jonów.

Mutageneza celowana pomogła wyjaśnić proces odczulania receptora. Wydaje się, że biorą w tym udział leucynowe odcinki łańcucha. W wykonanych przez mój zespół badaniach z zastosowaniem znakowania przez powinowactwo chloropromazyna znakowała pierścień złożony z obojętnych cząsteczek leucyny, znajdujący się w połowie długości kanału. Kiedy zespołom Bertranda i mojemu udało się zamienić cząsteczki leucyny w tym pierścieniu na mniejszy aminokwas obojętny, stworzyliśmy jednostkę przypominającą receptor w stanie odczulonym (w tym sensie, że wiązała się ściśle z acetylocholiną). Kanał jednak pozostawał otwarty. Wynik ten wskazuje, że funkcja zamknięcia kanału w konformacji odczulonej należy do pierścienia reszt leucynowych.

 Ja i moi współpracownicy zastanawialiśmy się często, jakie korzyści może czerpać organizm z receptorów zdolnych do przybierania różnych stanów konformacyjnych. Mechanizm odczulający będzie, rzecz jasna, chronił komórkę, na której występują receptory, przed nadmiernym pobudzeniem przy niebezpiecznie wysokich poziomach acetylocholiny. Sądzę jednak, że to nie wszystko.

W 1982 roku wraz z moim kolegą Thierrym Heidmannem zasugerowaliśmy, że zdolność receptorów acetylocholinowych do powolnej zmiany swojej konformacji może służyć do zwiększania lub zmniejszania efektywności przekazywania sygnału w synapsie. Zachowujące się tak receptory mogłyby uczestniczyć w procesie uczenia się. Wielu teoretyków, którym przewodzi Donald O. Hebb, postuluje, że proces uczenia się zależy od zmian w efektywności przekazywania sygnału przez synapsę łączącą dwie komórki, które są jednocześnie pobudzane.

Nasza teoria daleka jest od dowiedzenia, ale wydaje się bardzo prawdopodobna. Jeżeli dla regulacji przekazywania sygnałów ma znaczenie zdolność przyjmowania różnych postaci, to elastyczność taka powinna występować również w innych typach receptorów. Badania wykazują, że receptory GABA oraz glicynowe i serotoninowe też mogą przybierać konformację stanu odczulonego.

Wykazanie, że inne receptory mogą przybierać rozmaite formy, nie jest jedynym poparciem koncepcji regulowania efektywności synaptycznej przez receptory. Receptory są wyjątkowo dobrze usytuowane, by kontrolować stopień reaktywności wymagany w danym momencie. Sposób, w jaki przenikają przez błonę komórkową, powoduje, że są one wystawione na działanie sygnałów chemicznych i elektrycznych, pochodzących zarówno z zewnątrz, jak i z wnętrza komórki. Gdyby każdy z tych sygnałów popychał receptor do przyjęcia takiej lub innej konformacji, to ostateczny wynik odzwierciedlałby łączny wpływ rozmaitych, być może czasem sprzecznych oddziaływań.

Do sygnałów wpływających na receptor należą wewnątrzkomórkowe stężenie jonów wapnia i zmiany potencjału elektrycznego pomiędzy obiema stronami błony komórkowej. Hiperpolaryzacja błony i wzrost stężenia wapnia przyspieszają odczulenie receptora acetylocholinowego w mięśniu. W 1986 roku Richard L. Huganir i Paul Greengard z Rockefeller University ustalili ponadto, że odczuleniu sprzyja też fosforylacja receptora.

Gdyby receptory w istocie kontrolowały efektywność przekazywania sygnałów międzykomórkowych, należałoby oczekiwać, że powinny być zdolne do przechodzenia nie tylko w stan zmniejszonej, lecz także zwiększonej reaktywności na neuroprzekaźniki. Zjawisko zwiększenia pobudliwości zostało istotnie zaobserwowane. Wapń zewnątrzkomórkowy wzmaga pobudzające działanie nikotynowego receptora acetylocholinowego w mózgu, a glicyna nasila działanie receptorów glutaminianowych.

Zatem podejrzewamy, że jeśli receptor oscyluje pomiędzy dwiema konformacjami, z których jedna jest wrażliwa, a druga oporna na stymulację, to równowaga ta może być przesunięta w stronę jednego ze stanów pod wpływem sygnału chemicznego lub elektrycznego. Przyjęta w ten sposób konformacja z kolei wzmaga lub osłabia zdolność receptora do natychmiastowego przekazywania sygnałów.

Bez wątpienia nasze rozumienie chemicznego przekaźnictwa sygnałów w mózgu znacznie wzrosło w ciągu ostatniego ćwierćwiecza. Wybór rybich narządów elektrycznych jako materiału do izolacji receptora acetylocholinowego był decyzją ryzykowną. Gdyby to się nie powiodło lub gdyby okazało się, że tak otrzymany receptor nie jest spokrewniony z żadnym innym, zmarnowalibyśmy wiele czasu i pracy. Na szczęście to posunięcie opłaciło się bardziej, niż mogliśmy się spodziewać. Receptor acetylocholinowy pochodzący z ryb elektrycznych został zidentyfikowany, a jego sekwencja rozszyfrowana.

Następnie biotechnologia, a przede wszystkim techniki rekombinacji DNA umożliwiły naukowcom scharakteryzowanie pokrewnych receptorów w ludzkich mięśniach i mózgu oraz ustalenie, że receptory acetylocholinowe są strukturalnie spokrewnione z receptorami GABA, glicynowym i serotoninowym, tworząc wraz z nimi wielką rodzinę.

W tym czasie stało się jasne, że pod- jednostki tworzące różnego typu receptory także występują w rozmaitych odmianach: receptor pochodzący z jednego obszaru mózgu może mieć własności różniące go od najbardziej pokrewnej mu struktury w innej okolicy mózgowej. To otwiera niezwykle kuszącą perspektywę opracowania leków, które działałyby na ściśle określone typy receptorów wybranego rodzaju komórek nerwowych, co umożliwi wybiórcze leczenie zaburzeń przekaźnictwa w mózgu.

Autor: Jean-Pierre Changeux

Tłumaczył: Andrzej Bidziński

Linki dotyczące autora:
Krótkie video dotyczące autora artykułu, prezentujące również książki przez niego napisane (niestety po francusku).
Link do książki Jean-Pierre Changeux'a - "Neuronal Man"
Inne książki autora na Amazon.com

Literatura polecana:

Po angielsku:

NEURONAL MAN: THE BIOLOGY OF MIND. J. R Changeux. Hum. Laurence Garey, Pantheon book's, 1985.

FUNCTIONAL ARCHITECTURE AND DYNAMICS OF THE NICOTINIC ACETYLCHOLINE RECEPTOR: AN ALLOSTERIC LIGAND-GATED ION CHANNEL. J. P. Changeux, FIDIA Research Foundation Neurosctence Award Lectures, vol. 4, Raven Press, 1990.

EXPLORATIONS OF THE NICOTINIC ACETYLCHOLINE RECEPTOR. A. Karlin, Harvey Lectures; 1989-1990, vol. 85, ss. 71-107,1991.

THE FUNCTIONAL ARCHITECTRURE OF THE ACETYLCHOLINE NICOTINIC RECEPTOR EXPLORED BY AFFINITY LABELING AND SITEDIRECTED MUTAGENESIS. J. P. Chan- geux, J. L. Galzi, A. Devillers-Thiery i D. Bertrand, Quarterly Reviews of Biophysics, vol. 25, nr 4, ss. 395-432, XI/1&2.

NICOTINIC ACETYLCHOLINE RECEPTOR AT 9

A RESOLUTION. N. Unwin, Journal of Molecular Biology, vol 229, nr 4, ss. 1101- 1124,20II1993.

Multimedia
Jak diałają neurony oraz synapsy - proste wytłumaczenie (oprac. Citronian-Man)
Działanie receptorów acetycholiny na powierzchni mięśniowej (oprac. Citronian-Man)
Alloestryczna (pośrednia) aktywacja receptorów GABAA przez steroidy 

Działanie nauronów i struktura synapsy
Działanie synaps pobudzających i hamujących, pokazane na bardzo ładnych animacjach

Zachęcamy do dyskusji na temat podanych w artykule treści
oraz wklejania linków do materiałów multimedialnych.

Redakcja.